近十年来，晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗，尤其是靶向治疗，取得了极大的进展，可明显提高患者治疗的客观缓解率和延长无进展生存时间（PFS），并显著提高生活质量。分子分型是 NSCLC 实施靶向治疗的前提。
选择准确、快速、恰当的检测方法，全面筛选出适用靶向药物的目标人群具有重要临床意义。同时，随着少见基因变异的不断发现以及靶向药物获得性耐药机制的完善，临床对基因检测的内涵提出了更多的需求。
分子病理检测的方法多样，包括 Sanger 测序、即时定量 PCR（qRT-PCR）、荧光原位杂交（FISH）、二代测序（NGS）及免疫组织化学（IHC）等，各种检测方法具有不同的优缺点，需根据检测内容及临床需求选择恰当的检测方法。单基因检测是现阶段广泛获批的检测方法，具有快速、易开展的特点；多基因检测可一次为患者提供多种基因变异信息。现阶段，多重 PCR 检测和小 Panel 二代测序试剂盒均已经获得国家药品监督管理局（NMPA）的批准，可同时检测多个基因变异；二代测序技术能够在 DNA 及 RNA 水平进行更多基因、多位点检测，是未来分子病理的发展方向。
NSCLC 基因变异检测主要包括靶向治疗及免疫治疗相关分子病理检测。我国 NSCLC 患者分子变异谱不同于西方人群，主要体现在腺癌，包括常见变异基因表皮生长因子受体（EGFR，45%～55%）、KRAS（8%～10%）、间变性淋巴瘤激酶（ALK，5%～10%），少见变异基因 ROS1（2%～3%）、MET（2%～4%）、HER2（2%～4%）、BRAF（1%～2%）、RET（1%～4%），以及罕见变异基因 NTRK（<1%）、NRG1/2（<1%）、FGFR2（<1%）等。
免疫治疗相关分子病理检测包括 PD-L1 蛋白表达和 TMB。其他生物标志物，如高度微卫星不稳定（MSI-H）在 NSCLC 中罕见。如何规范进行 NSCLC 患者基因检测，使得肺癌患者得到最佳的分层治疗方案，一直是临床医师努力的方向。笔者结合最新版《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南 (2021 版) 》进行归纳总结。
基因检测适用人群
1、拟接受靶向治疗的肺浸润性腺癌（或包括含腺癌成分的 NSCLC）。
2、经活检组织病理学证实为非腺癌的晚期 NSCLC 患者可推荐进行靶分子基因检测。除肺腺癌外，靶分子基因变异在其他 NSCLC 患者（如肺腺鳞癌、非特指 NSCLC、大细胞肺癌及肺肉瘤样癌等）中真实存在，且患者可在靶向药物治疗中获益。
3、所有 EGFR、ALK 基因变异阴性晚期 NSCLC 患者，如拟进行 PD-1/PD-L1 抗体药物免疫治疗，推荐进行 PD-L1 表达检测。对拟实施抗 PD-1/PD-L1 免疫治疗的 NSCLC 患者，可选择进行 TMB 检测。
基因检测送检标本类型规范
1、检测标本优先使用肿瘤组织石蜡标本：主要包括手术、纤维支气管镜下活检、CT 引导下肺穿刺、胸腔镜、淋巴结穿刺活检等方法获取的标本。检测前需对肿瘤细胞比例进行评估，满足检测要求后方可进行检测。对于手术标本，优先选取肿瘤细胞比例较高的标本进行基因检测。若肿瘤细胞比例较低，可通过富集，以保证检测结果的准确可靠。
2、细胞学标本：包括胸腔积液、经皮肺穿刺活检、支气管内超声引导细针穿刺活检（EBUS-FNA）、痰、肺泡灌洗液等，需制作成石蜡包埋标本，进行肿瘤细胞比例评估，满足检测要求后可进行检测。
3、对于少数不能获得组织或细胞学标本的晚期肺癌患者，推荐血液检测（液体活检）。晚期 NSCLC 患者的血液中存在循环游离肿瘤 DNA（ctDNA），其血浆中 ctDNA 有更高的检出率。
4、对于部分晚期发生脑膜转移的 NSCLC 患者，脑脊液对颅内肿瘤的 ctDNA 具有富集作用，可通过腰椎穿刺获取脑脊液进行相关基因检测。
不同突变基因检测规范
1、EGFR
EGFR 基因变异包括基因突变（点突变、插入/缺失突变），主要发生在编码 EGFR 酪氨酸激酶区的第 18～21 号外显子，以及获得性耐药突变（包括第一、二代 TKI 的耐药突变 T790M 和第三代 TKI 的耐药突变 C797S 等）。
EGFR 基因突变常用检测方法及位点要求：目前 EGFR 基因突变检测的方法有很多种，临床常用的检测方法包括 Sanger 测序法、qRT-PCR 法和二代测序等。不管使用何种检测方法，均应包括 EGFR 最主要的突变位点外显子 19 缺失（19del）和外显子 21 点突变（L858R），还应包括外显子 18 点突变（G719X），外显子 20 插入突变（20ins）和点突变（T790M、S768I），外显子 21 点突变（L861Q）等。
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不同检测手段的优缺点
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Sanger 测序法
是直接可检测已知和未知突变的一种方法，是早期广泛应用的 EGFR 基因突变检测方法。但 Sanger 测序法检测 EGFR 基因突变的灵敏度较低，操作步骤复杂、容易产生污染，已不能完全满足临床 EGFR 基因突变检测的需求。
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qRT-PCR
基于 qRT-PCR 的方法，需要根据 EGFR 基因已知的突变类型设计引物探针，无法检测出所有可能的突变，但灵敏度相对较高，操作简单，无需对 PCR 产物进行操作，在很大程度上避免了扩增产物的污染，易于在临床开展，是目前 EGFR 基因突变检测最常用的检测技术之一。
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二代测序
二代测序是一种高通量测序技术，能够同时对多基因、多位点进行测序。相较于传统测序技术，二代测序可以一次性检测大量靶基因，能够分析基因变异的丰度，相对成本低。然而二代测序操作步骤多、程序复杂，任一环节出现问题，都会影响检测结果的准确性，结果的判读依赖生物信息的准确分析。二代测序检测 EGFR 基因突变，检测位点更加全面，可以发现罕见突变位点，为晚期 NSCLC 患者的全流程管理提供依据。
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耐药机制检测
目前 EGFR TKI 的耐药机制已经基本明确，大部分是由 EGFR T790M 的获得性突变，约占 50%。其他机制包括 MET 基因扩增、KRAS 突变、BRAF 突变等。因此，对于第一、二代 EGFR-TKI 耐药患者，优先推荐进行 T790M 检测（qRT-PCR 或二代测序）。也可同时与其他耐药机制进行检测或 T790M 检测阴性后用高通量技术（二代测序）进行其他耐药机制的检测。第三代 TKI 耐药患者，推荐进行二代测序检测耐药机制。
2、ALK
ALK 基因变异类型包括基因重排/融合，以及获得性耐药突变（点突变为主）。ALK 激酶区的获得性突变是 ALK 抑制剂治疗耐药的主要机制之一，对指导耐药患者的后续临床治疗具有一定的指导意义。
ALK 基因变异常用检测方法及主要特点：ALK 基因重排导致 ALK 融合基因的表达，可以在多个分子水平上进行检测，包括 FISH 在 DNA 水平上检测 ALK 基因重排；qRT-PCR 检测 ALK 融合 mRNA；IHC 检测 ALK 融合蛋白表达，以及二代测序检测 DNA 水平上的重排序列或 mRNA 水平上的融合序列。
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不同检测手段的优缺点
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ALK Ventana D5F3 IHC 检测
是目前最快速、经济的方法，并且二元结果判读标准简便易行。该判读标准仅适用于肺腺癌，该检测在用于鳞癌、神经内分泌癌等其他类型肺癌标本时应谨慎，疑似阳性标本需要使用其他方法进行验证。在临床实践中要警惕 IHC 结果判读中存在的陷阱，避免非特异性着色。
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FISH 检测
是检测 ALK 重排的「金标准」，检测结果判读直观，对样本质量要求较低，但费用较高、经济效益比不佳。并且在 FISH 判读时，对于处于临界值分离信号、不典型分离信号等的判定需要格外谨慎，推荐利用其他技术平台复核检测。
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qRT-PCR
基于 qRT-PCR 方法的 ALK 融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，但因为 qRT-PCR 只能检测已知 ALK 融合基因类型，所以存在假阴性。另外，由于 qRT-PCR 基于 mRNA 扩增技术，因此实验室内、外部质控等应制定最严格的技术标准，防止污染。
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二代测序
二代测序可在血液中检出 ALK 基因变异，但应注意假阴性结果的出现，必要时选择其他平台或检测手段进行复测。
3、ROS1
ROS1 基因变异包括 ROS1 基因重排。目前共发现十余种 ROS1 基因融合伴侣，主要包括 CD74、SLC34A2、CCDC6、TPM3、EZR 等，其断裂位点主要位于 ROS1 基因的第 32～36 号外显子。
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ROS1 基因检测方法及主要特点：
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ROS1 基因重排/融合表达检测各种方法学与 ALK 相似，但 IHC 抗体特异性不佳，目前不能直接用于检测 ROS1 基因重排/融合表达，仅可用于 ROS1 基因融合初筛。
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基于 qRT-PCR 方法的 ROS1 融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，且可与 ALK 联检。
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FISH 检测是检测 ROS1 重排的「金标准」。
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二代测序检测 ROS1 基因变异同样可在 DNA 水平上检测重排序列，也可在 mRNA 水平检测融合序列，但由于 ROS1 基因序列的特殊性，基于 DNA 水平的二代测序检测灵敏度受文库探针设计及生物信息学分析能力影响较大，应注意假阴性。
4、MET
在 NSCLC 的临床实践中，根据已有的循证医学证据，目前主要关注 MET 第 14 号外显子跳跃突变和 MET 扩增的检测。MET 扩增包括原发扩增和继发扩增，其中继发扩增较多见于驱动基因阳性患者经 TKI 治疗进展后，是 EGFR-TKI 治疗耐药的重要机制之一。
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MET 基因变异的常用检测方法及主要特点
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MET 第 14 号外显子跳跃突变的检测，包括二代测序或 qRT-PCR 直接检测缺失 MET 第 14 号外显子的 mRNA，或二代测序在 DNA 水平上检测可能导致 MET 第 14 号外显子剪切的基因变异。
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基于 RNA 的检测在临床实践中应注重 mRNA 质量，在检测前应做好质控，如发现 mRNA 已经降解建议重新取材检测。MET 基因探针覆盖范围不够可能导致基于 DNA 的二代测序发生漏检，建议二代测序检测应尽量涵盖第 14 号外显子外的如第 13 或 14 号内含子上可能发生剪切变异的区域。
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原位杂交检测是检测 MET 扩增的标准方法。目前临床研究中不同的 FISH 判读标准 ［Cappuzzo 标准和 UCCC（University of Colorado Cancer Center）标准］ 均有使用，在临床实践中建议尽可能采用能够区分出定点扩增和多倍体的 UCCC 标准。
相较于 FISH，二代测序可用于 MET 扩增检测，但与 FISH 检测的对应性比较复杂，并可能遗漏 MET 多体，但是二代测序可同时检测 MET 突变和融合等其他变异，且能实现多基因共检，在临床实践中应用更广。
5、其他靶分子
除了上述靶分子外，HER2 基因突变或扩增、BRAF 突变、KRAS 突变、RET 基因重排、NTRK 家族基因重排等，均为 NSCLC 中重要的驱动基因变异，并是潜在的治疗靶点。他们的检测方法可参照基因点突变、基因重排类型的检测方法和检测策略。对于检测方案的选择及优化，更多的尚需临床实践的积累。
HER2 是酪氨酸激酶受体 ERBB 家族成员之一，HER2 基因突变或扩增是 NSCLC 的驱动基因之一，其中最常见的基因变异为 HER2 外显子 20 插入性突变，在 NSCLC 的突变率为 2%～4%。
BRAF 突变可导致 MAPK/ERK 信号通路异常活化，BRAF 突变常见位点为 V600，在 NSCLC 中变异频率为 1%～2%。
亚洲人群中 KRAS 基因突变率为 8%～10%，突变位点位于外显子 2 及 3，易发生在吸烟的肺腺癌患者，并且易伴发其他基因变异，如 LKB1、P53/ target=_blank class=infotextkey>P53、CDKN2A/B 等，KRAS 突变与患者预后差、耐药等相关。
NSCLC 中 RET 融合基因变异频率为 1%～4%，最常见的 RET 基因融合伴侣为 KIF5B（70%～90%）和 CCDC6（10%～25%）。NTRK 融合基因在 NSCLC 中罕见，发生率小于 0.1%。
免疫治疗生物标志物检测规范
1、PD-L1
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PD-L1 表达检测
通过 IHC 检测肿瘤细胞和/或免疫细胞 PD-L1 的表达水平是目前判断 NSCLC 患者能否从免疫检查点抑制剂治疗中得到更多获益的主要评估手段。
目前我国已批准 3 种标准化的 PD-L1 检测商用试剂盒用于临床检测，包括配套 Dako 平台的 PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 试剂盒及浓缩液、PD-L1 IHC 28-8 pharmDx 试剂盒以及配套 Ventana 检测平台 SP263 试剂盒。未上市的检测试剂还包括基于 Ventana 检测平台的 SP142 试剂盒。
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PD-L1 表达检测临床实践常见问题及解决策略
经 3.7% 中性甲醛固定石蜡包埋的肿瘤组织样本是检测 PD-L1 表达标准的标本类型。手术切除标本和活检标本均可进行 PD-L1 检测。由于肿瘤具有异质性，PD-L1 表达在瘤内和瘤间存在一定的异质性。采用活检标本进行 PD-L1 应保证足够的标本量。
目前，仅组织学标本被批准用于 PD-L1 检测，细胞学标本尚未经过临床验证，实验室需做好充分的方法验证和质量控制；在组织学标本不可获得的情况下，可尝试用细胞学蜡块标本进行 PD-L1 检测，但在报告中应予以必要的说明，仅供临床参考。应合理安排驱动基因检测和 PD-L1 检测，建议同时检测，当标本有限时，尤其是肺腺癌患者，应优先考虑驱动基因检测（EGFR、ALK、ROS1 等）。
2、TMB
对于 TMB 的检测，目前还没有通用标准值和检测流程，但在部分临床研究和实践中已经在使用的生物标志物，涉及二代测序 Panel 设计及算法，以及肿瘤人群数据的划分，相对复杂，国际上也暂无指南共识，仅有个别检测方法获批，因此还需要更多的临床试验及真实数据的验证。
